Le biomolecole sono sostanze prodotte dagli organismi viventi, caratterizzate da diverse dimensioni e ruoli fisiologici. Una prima classificazione di biomolecole vede carboidrati, proteine, acidi nucleici, lipidi e vitamine. Per via delle loro applicazioni terapeutiche e della loro grande specificità sono diventate di grandissimo interesse per l’industria farmaceutica. Le biomolecole, in molti casi, possiedono dimensione più elevate (in termini di massa molecolare) rispetto a quelli che sono considerati gli standard della maggior parte dei principi attivi sviluppati fino a qualche decennio fa. Questo è uno dei motivi principali che determina la formazione di miscele molto complesse, contenenti numerose impurezze, la cui separazione e studio richiede l’utilizzo di tecniche analitiche adeguate: la cromatografia liquida è una tra le più utilizzate e versatili. Considerata la grande varietà di gruppi funzionale che possono essere presenti in una biomolecola, nell’analisi mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) ci si può avvalere di metodologie basate ad esempio su fase inversa (reversed phase HPLC), esclusione molecolare (size exclusion HPLC), scambio ionico (ion exchange HPLC) o interazione idrofobica (hydrophobic interaction HPLC). L’approccio allo studio e alla separazione delle biomolecole è strettamente legato alla valutazione della polarità, conformazione e dimensione delle biomolecole stesse, caratteristiche direttamente legate ai meccanismi di ritenzione in colonna. Nella pratica, risulta cruciale la scelta del tampone, il pH della fase mobile, la fase stazionarie e l’utilizzo di eventuali reagenti di derivatizzazione. La scelta e la concentrazione del modificatore organico è fondamentale, in particolar modo per peptidi e proteine, indirizzando la separazione verso eluizioni in gradiente. Inoltre, lo studio delle caratteristiche chimico-fisiche delle biomolecole ha portato negli anni all’utilizzo di sistemi di rivelazione basati sulla spettrometria di massa, ed esempio: elettrospray (ESI), tempo di volo (TOF), orbitrap e risonanza ciclotronica a trasformata di Fourier (FTICR).
Molto spesso, nell’analisi di campioni che esibiscono miscele complesse, si tende ad utilizzare la cromatografia liquida ad altissima prestazione (ultra high performance liquid chromatography – UHPLC), con conseguente aumento della risoluzione, diminuzione dei tempi di analisi e minor utilizzo di solventi.
L’ottimizzazione dei metodi di analisi per le biomolecole è molto complessa e continuamente vengono richiesti numerosi sforzi per risolvere le problematiche che costantemente si presentano. Numerosissime sono le ricerche che spingono in questa direzione, garantendo alle biomolecole di occupare un ruolo da protagoniste nel panorama dell’industria farmaceutica del futuro.
Riferimenti
- Andrea Krumm. The Future of Biomolecule Analysis Using HPLC/UHPLC, LCGC International, 2023.
- Mark Woodruff. The use of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) columns in Biomolecule analysis, Chromatography Today, 2016.
- HPLC Analysis of Biomolecules Technical Guide – Successful Separations of Peptides, Proteins and Other Biomolecules, Thermo Fisher Scientific, 2010.
- Evert-Jan Sneekes, Remco Swart, and Mauro De Pra. How does the analysis of biomolecules benefit from UHPLC?, Thermo Fisher Scientific, 2016.
